实时荧光定量PCR

日期：2018-07-05

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，根据荧光积累水平测定每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法可以对待测样品中的特定DNA序列进行定量或定性分析。

原理：

其原理是在定性PCR反应体系中加入荧光基团，利用扩增过程中荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程，最后通过标准曲线或者比较Ct值对样本中模板进行定量或定性分析。

技术原理：

实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：

 1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收使得仪器无法接收到信号；PCR扩增时，Taq酶的5’→3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离从而发射出荧光信号，荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

2）SYBR Green荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green荧光染料，荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR Green仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。

3）分子信标：是一种在5’和3’末端自身形成一个由8个左右的碱基组成发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。

相关应用：

1）临床疾病诊断

各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。

2）动物疾病检测

禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病、炭疽芽孢杆菌等检测。

3）食品安全

食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。

4）科学研究

医学、农牧、生物相关分子生物学定性定量研究。